內(nèi)切酶實驗的注意事項有哪些？

你知道內(nèi)切酶實驗的注意事項有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、限制性內(nèi)切酶一般反應(yīng)條件

當(dāng)進行限制性酶切反應(yīng)時，為確保最佳的反應(yīng)條件，務(wù)必要遵守限制性內(nèi)切酶供應(yīng)商提供的建議。在此過程中需要考慮的重要參數(shù)包括：底物 (DNA) 和酶的量、反應(yīng)體積以及孵育時間。

根據(jù)傳統(tǒng)的定義，在最佳反應(yīng)條件下，一個單位的限制性內(nèi)切酶可以在1小時內(nèi)，在50μL體系中 wan全酶切1μL 定義底物（例如，質(zhì)粒 pUC19）。盡管單位定義提供了一種測定方式，但還需注意，根據(jù) DNA 底物之中的識別序列出現(xiàn)的頻率及所用底物類型，針對不同DNA底物使用等量的限制性內(nèi)切酶可能需要不同的最佳反應(yīng)條件。實際上，酶供應(yīng)商往往根據(jù) DNA 樣本的潛在質(zhì)量、數(shù)量和性質(zhì)波動，推薦比wan全酶切所需量多5至20倍的酶（或1μL 酶/反應(yīng)體積）。

二、星號活性

星號或“松弛"活性是限制性內(nèi)切酶的一種固有性質(zhì)，即在非最you反應(yīng)條件下，限制性內(nèi)切酶可能會作用于與其天然識別位點存在細(xì)微差異的識別序列。例如，如下圖所示，EcoRI 可以識別和切割位點5’-GAATTC-3’，但其星號活性可能導(dǎo)致序列在5’-TAATTC-3’和5’-CAATTC-3’處被切割。同樣，BamHI 除了可切割其正常的識別序列 5’-GGATCC-3’ 外，還可切割 5’-NGATCC-3’、5’-GPuATCC-3’和 5’-GGNTCC-3’（其中 N 代表任意核苷酸）。

需特別指出，在最佳反應(yīng)條件下，“星號"位點的切割率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常的識別位點（大約相差 105–106）。因此，酶切期間出現(xiàn)星號活性的常見原因為限制性內(nèi)切酶過量和/或孵育時間過長（過度酶切）。此外，高濃度甘油（例如，>5%）、低濃度鹽、非最佳 pH、存在有機溶劑，以及除 Mg2+ 之外的二價陽離子都可能造成底物 DNA 的非特異性切割。使用酶制造商推薦的實驗方案和緩沖液，可避免出現(xiàn)星號活性。

三、不wan全酶切

不wan全酶切是在限制性內(nèi)切酶使用過程中常遇到的問題之一。當(dāng)酶量過多或過少時，都可能發(fā)生不wan全酶切。DNA 樣本中存在污染物也可能導(dǎo)致不wan全酶切。緩沖液組分、孵育時間和反應(yīng)溫度等欠佳的反應(yīng)條件是不wan全酶切的常見原因。

部分限制性內(nèi)切酶需要輔因子才能實現(xiàn)wan全活性。例如，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而 Eco57I (AcuI) 需要 S-腺苷甲硫胺酸。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限制性內(nèi)切酶需要兩個拷貝的識別位點才能實現(xiàn)有效切割；針對這一類酶，通常向反應(yīng)物之中添加一份帶有識別位點的寡核苷酸來增強酶活性。

除了反應(yīng)條件和酶性質(zhì)外，DNA 自身的性質(zhì)也會影響限制性酶切。甲基化的 DNA 可耐受部分限制性內(nèi)切酶的切割（詳見甲基化部分）。酶的識別位點過于接近終端（線性底物 DNA 中）以及切割位點相鄰（雙酶切）都可能影響酶切割 DNA 的效率）。此外，部分超螺旋 DNA 分子要比線性 DNA 分子更難切割，增加 5-10 倍的酶量可有助實現(xiàn)wan全酶切。

四、酶切圖譜不正常

即便遵守了制造商的使用說明，仍可能觀察到預(yù)料之外的底物 DNA 切割結(jié)果。為避免陷入此類困境，必須確保酶和 DNA、反應(yīng)所用的試劑均不含污染物（例如，其它限制性內(nèi)切酶、DNA 和核酸酶）。

出現(xiàn)預(yù)料之外切割的一個原因是，在增殖和擴增過程中，底物 DNA 引入了突變。突變可能破壞已知的識別位點或創(chuàng)造出新的識別位點，從而產(chǎn)生預(yù)料之外的酶切結(jié)果。對 DNA 進行Sanger 測序，是一種判斷突變是否引起底物 DNA 出現(xiàn)預(yù)期外切割的有效方法。

有時候預(yù)期之外的酶切圖譜是由檢測過程而非酶切過程造成的。部分限制性內(nèi)切酶（例如，F(xiàn)okI，TauI）可能會與 DNA 緊密結(jié)合，導(dǎo)致電泳時出現(xiàn)明顯的凝膠遷移。使用含 SDS 的上樣染料，加熱使酶從切割的 DNA 上解離開來，均可避免出現(xiàn)這類凝膠遷移現(xiàn)象。